Chromatographie sur
colonne d’un sirop de menthe
La technique de chromatographie sur colonne
repose sur le même principe que la chromatographie sur couche mince : les
espèces chimiques à séparer sont plus ou moins entraînées par un éluant
sur une phase fixe :
- La phase fixe est un solide, le plus souvent de la silice ou de l’alumine
remplissant une colonne ;
- L’échantillon est déposé en haut de la colonne. La séparation des
espèces chimiques est obtenue par l’écoulement continu d’une phase
mobile (l’éluant) à travers la colonne ;
La séparation est basée sur une différence de vitesses d’entraînement
des espèces chimiques vers le bas de la colonne. L’objectif de ce TP est donc
de séparer les constituants colorés d’un sirop de menthe
(colorants alimentaires : le E102 et le E131) puis de montrer l’intérêt
de la chromatographie sur colonne vis à vis de la chromatographie sur couche
mince.
I. Séparation des colorants
alimentaires d’un sirop de menthe
1. Préparation de la colonne (phase fixe)
L’opération de remplissage de la colonne conditionne l’efficacité
de la séparation. Il ne faut pas qu’il y ait de bulles ou de zone sans phase
stationnaire car on aurait alors des chemins préférentiels nuisant à une
bonne séparation des composés. Pendant la phase d’élution avec le solvant
on veillera également à ne pas assécher la partie supérieure de la phase
fixe.
- Fixer verticalement la colonne à l’aide d’une pince ;
- Déposer un petit morceau de coton dans le bas de la colonne ;
- Peser environ 10 g de silice ;
- Introduire la silice dans la colonne ;
- Tapoter la colonne afin d’obtenir une surface plane de silice ;
- Placer un bécher sous la colonne ;
- Introduire doucement de l’eau distillée (à l’aide d’une pipette
plastique par écoulement de long de la paroi de la colonne). Ajouter une
quantité d’eau suffisante pour être environ à 2 cm au dessus de la
surface plane de la silice.
2. Dépôt de l’échantillon à séparer
- Déposer très doucement à l’aide d’une pipette, sans toucher les
parois de la colonne, l’échantillon de sirop de menthe : attention à
ne pas déformer la surface de la phase stationnaire pendant cette
opération ;
- Lorsque le sirop de menthe a pénétré à la surface de la phase
stationnaire, éluer avec l’eau en remplissant la colonne ;
- Lorsque le premier colorant arrive en bas de la colonne le récupérer
dans une première cuve ;
- Eluer ensuite avec un autre éluant : un mélange d’éthanol + eau
salée ;
- Lorsque le second colorant parvient en bas de la colonne, le récupérer
dans une seconde cuve.
Quel est l’intérêt de ce type de chromatographie par
rapport à celle sur couche mince ?
- Analyse spectrophotométrique des colorants
A l’aide d’un spectrophotomètre, on souhaite tracer les
spectres d’absorption A=f(l ) du sirop de
menthe et des 2 colorants issus de la séparation précédente.
Réaliser ce spectre en tenant comptes des remarques
suivantes :
- Faire varier la longueur d’onde entre 400 et 720 nm
- Une dilution des solutions sera éventuellement nécessaire si la valeur
maximale mesurable par le spectrophotomètre est atteinte (balayer
rapidement la gamme de longueur d’onde puis observer la valeur maximale de
l’absorbance)
- Le réglage du zéro se fera sur de l’eau distillée. Il est
indispensable de le faire pour toutes les longueurs d’ondes.
- Tracer à l’aide de synchronie les 3 courbes sur une même fenêtre
(fenêtre 1). On créera pour cela les variables
" lambda ", " Av ", "Aj "
et " Ab " puis on rentrera au clavier les valeurs
mesurées.
- Interpréter les courbes obtenus. Sont-elles conformes à ce que l’on
pouvait prévoir ? Interpréter chacune d’elle.
Matériel
Elèves :
- Un support avec noix
- Une pince en bois
- Une tulipe sans robinet
- Une petite coupelle en plastique
- Spatule
- Spectrophotomètre
- 3 cuves spectro
- 3 béchers
- 3 pipettes plastiques
Au bureau :
- Coton
- Silice broyée à l’aide du mixer (tamiser ensuite la poudre obtenue)
- Sirop de menthe " Sport "
- Un bécher
- Ethanol à 95
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Bénédicte COLLIAU et
Professeurs de sciences-physiques
Lycée Augustin Thierry 41000 Blois